一次性使用的組件為生物制品的生產(chǎn)帶來了很多優(yōu)勢。它們干凈、買來即用、不需要滅菌，因此也就減少了如沖洗用水系統(tǒng)（WFI）和蒸汽發(fā)生器檢修的需求。一次性的組件不能用于后續(xù)的操作，消除了工藝流程運行之間交叉污染的可能性。因為減少或擯棄了對不銹鋼設備的需求，也可以避免了設備組裝的長周期。系統(tǒng)的復雜度降低，因而所涉及的工程需求也同樣減少。再也無需在位清洗（CIP）或在位滅菌（SIP）操作，以及相關(guān)的管道、閥門、控制器或容器的壓力等級。此外，一次性組件的使用還降低了驗證的復雜度。因為幾乎沒有可反復使用的組件，也就沒有什么項目需要跟蹤，也就節(jié)省了大量的滅菌、清潔驗證研究。zui后，通過消除了堅固的管道系統(tǒng)和固定發(fā)酵罐的限制，一次性組件還有利于實現(xiàn)更快速的改裝以便用于新流程的運行。一次性組件的使用可在勞力、設備、廠房設計以及驗證方面實實在在地節(jié)省可觀的費用。一次性的組件包括：生物處理袋、管、囊式過濾器、切向流艙、生物反應器、層析艙及混合系統(tǒng)。
圖1. 波浪生物反應器。20/50EH 系統(tǒng)。
一次性生物反應器的使用及放大
在某些應用中，灌流式細胞培養(yǎng)比分批和補料分批工藝更具優(yōu)勢。操作方式的選擇是根據(jù)工藝規(guī)程所的綜合需求。工藝的優(yōu)化常常是評估哪種類型生產(chǎn)zui有效的*途徑。分批是zui常用的以終點為依據(jù)的生產(chǎn)方式。在分批生產(chǎn)方式中，生物反應器在接種、培養(yǎng)并達到的細胞密度和產(chǎn)品濃度的時即收集細胞上清。在補料分批工藝中，在生產(chǎn)流程的晚期進行補加原料以改進細胞活力，增加總的產(chǎn)率。在灌流方式中，原料溶液持續(xù)加入生物反應器中，用過的培養(yǎng)基也不斷排出。以灌流方式來運行工藝能增加培養(yǎng)的持久性和細胞密度，反過來又增加了整體的生產(chǎn)率3,4,9。我們的目的蛋白，AZ-IL2B，是一個二聚體融合蛋白，由人IL-2 連接人免疫球蛋白特異針對pIgR 的scFv 區(qū)域而組成6。這個融合蛋白灌流方式的生產(chǎn)。細胞產(chǎn)生的蛋白水平較低，而且AZ-IL2B 很脆弱，特別是在37º C。灌流生產(chǎn)所帶來的生產(chǎn)容量增加，以及縮短了不穩(wěn)定蛋白在反應器中停留的時間，都有助于實現(xiàn)更高的產(chǎn)量。本文總結(jié)了Wave Biotech, LLC所生產(chǎn)的一次性生物反應器以灌流方式從25 升 工作體積放大至500升 工作體積的生產(chǎn)放大結(jié)果。我們將比較25 升、100 升和500 升 工作體積的三個不同系統(tǒng)。對于每個生物反應器的運行都測定了以
下參數(shù)，包括：細胞數(shù)量和活力、產(chǎn)生的蛋白數(shù)量、葡萄糖和乳酸水平。對每個系統(tǒng)間的這些參數(shù)進行了比較，結(jié)果顯示三個不同體積的生物反應器是相當?shù)摹?/span>
材料與方法生物反應器描述
每個生物反應器由一個靈活的、一次性的、預先滅菌的塑料袋組成， 這個塑料袋稱為細胞袋(Cellbag®)。在操作中，細胞袋放置在搖擺平臺上,充入部分培養(yǎng)基（圖1）。細胞袋的剩余體積則充入了由二氧化碳（CO2）和氧氣（O2）組成的氣體混合物。這些氣體是通過預留在細胞袋上的無菌過濾入口來添加的。空氣流提供了氧氣，以及控制pH和去除二氧化碳所需的氣體交換。廢氣則通過另一個無菌過濾器和背壓控制閥排出。背壓控制閥確保了細胞袋在任何空氣流下總是充滿的。閥門也防止了細胞袋的過度膨脹以及爆炸的可能。填充空氣的頂部空間占據(jù)了細胞袋被填滿時的一半體積.例如，一個充滿時是50 升總體積的細胞袋將包含25升 細胞懸液和25 升 空氣?？諝庠谂囵B(yǎng)時持續(xù)地穿過頂部空間。流程中的氣體，如CO2和O2，以可控的方式與空氣混合。液體混勻以及氣體的物質(zhì)傳遞是通過來回搖動細胞袋而實現(xiàn)的。這種搖動在氣相和液相對分界面產(chǎn)生了波動。這些波動大大增加表面積，能提高氣體轉(zhuǎn)移。波浪運動還促進細胞和顆粒離開底部懸?。ǚ乐钩两担┮约按竺娣e混勻，同時不會給細胞帶來任何傷害。搖動可以通過設定搖擺角度和每分鐘的搖動次數(shù)來控制。這些參數(shù)必須根據(jù)細胞袋中的使用體積來確定。細胞袋的溫度可通過加熱器來控制，此加熱器位于設備的底盤，對細胞袋的底部進行加熱。加熱器是由同樣位于單元的底盤的非插入式的溫度傳感器來調(diào)節(jié)8。另外還設計了特別的接口，以供無菌加料及樣品的取出，而無需將生物反應器置于層流柜中。可用無菌的管道連接器將培養(yǎng)基、緩沖液和葡萄糖儲存液加入系統(tǒng)中。使用的生物反應器分別為20/50EH 系統(tǒng)、200 系統(tǒng)和1000 系統(tǒng)（WaveBiotech, LLC）。
細胞解凍與增殖
我們使用了P6A2細胞系，它是一種基于CHO的懸浮克隆，選擇這個細胞株的原因在于其蛋白生產(chǎn)及生長特性俱佳。細胞在120毫升過濾的培養(yǎng)基中解凍，并放置在150毫升的轉(zhuǎn)瓶內(nèi)。細胞在轉(zhuǎn)瓶內(nèi)擴增，直到有足夠的細胞來接種更大的轉(zhuǎn)瓶，一直至6升。一旦培養(yǎng)物充分擴增，即被轉(zhuǎn)移到細胞袋中接種。轉(zhuǎn)瓶內(nèi)的細胞密度維持在約2×105 細胞/毫升。用于擴增的培養(yǎng)基是帶有添加劑的無血清的IS CHO-V (IrvineScientific)。我們使用了血球計數(shù)器來計算細胞數(shù)量，并利用臺盼藍染料排除分析來確定細胞活力。利用Bioprofile® 300A (Nova Biomedical)來分析細胞培養(yǎng)試劑。pH值是通過細胞袋探頭進行在線測定，或用PHM220 pH計 (Meter Lab)來離線測定。氧氣、二氧化碳、溫度、搖速及搖擺角度是由Wave Bioreactor的控制器來測定并控制的。
細胞袋接種
細胞一般以1×105-4×105 細胞/毫升的密度接種在細胞袋生物反應器中。我們曾以更低的密度（如6×104 細胞/毫升）接種細胞，對細胞生長或生產(chǎn)也沒有不良影響。一旦細胞在轉(zhuǎn)瓶中充分擴增，就進行細胞袋生物反應器的接種。這可將轉(zhuǎn)瓶的內(nèi)容物直接轉(zhuǎn)移到生物反應器內(nèi)。在此時，生物反應器已經(jīng)充滿了二氧化碳和氧氣，并包含溫暖的培養(yǎng)基 (37° C)。細胞懸浮液由無菌接管連接到細胞袋，然后通過無
菌的端口泵入生物反應器中。
生物反應器里的增殖
細胞袋中的細胞能達到比轉(zhuǎn)瓶更高的密度。這zui有可能是由于細胞袋內(nèi)溶氧的增加，以及控制pH的能力。在轉(zhuǎn)瓶中， 密度維持在2×105-6×105 細胞/毫升，加入細胞袋后， 細胞的密度增加至8×105-1×106 細胞/毫升，直到在灌流開始后，P6A2細胞克隆的密度可高達3×107 細胞/毫升。
灌流
一旦細胞達到1×106-2×106 細胞/毫升，即可開始灌流。收集用過的培養(yǎng)基，同時以相同速率向生物反應器中加入新鮮的培養(yǎng)基、養(yǎng)分、調(diào)控pH的緩沖液。這是由生物反應器的以重量為基礎的灌流控制器來直接控制的。在這個細胞密度下每天的體積交換約為總體積的70-75%。只要細胞活力高于50%，反應器就持續(xù)灌流。一旦細胞密度達到約2×107 細胞/毫升，控制乳酸及其他毒副產(chǎn)物的累積就變得更加困難，反過來導致pH的控制也非常困難。到此階段，要移除部分細胞從而維持密度在1×107-2×107 細胞/毫升。每天的體積交換提高至約100%，包括培養(yǎng)基、緩沖液及其他添加劑。利用孔徑為0.2μm的中空纖維微孔過濾柱來灌流細胞培養(yǎng)上清。
通過ELISA和Western Blot進行蛋白分析
AZ-IL2B目標蛋白的定量是通過ELISA進行的。細胞培養(yǎng)上清是以一種于檢測和定量AZ-IL2B嵌合體的方法來分析的。細胞培養(yǎng)上清中的AZ-IL2B通過與包被pIgR區(qū)域特異性抗體的微滴定板的結(jié)合而被捕獲，捕獲的AZ-IL2B通過生物素標記的山羊抗人IL-2多克隆抗體（R&DSystems, Inc.）來檢測。鏈親和素-HRP 結(jié)合物（ BD Biosciences,Pharmingen）加入zui后的檢測步驟中。TMB底物溶液加入反應中，與
反應中存在的酶直接反映并產(chǎn)生顏色變化，這種顏色變化與樣品中AZ-IL2B的量成正比。利用AZ-IL2B標準曲線和質(zhì)量對照來測定細胞培養(yǎng)上清樣品中AZ-IL2B的量。根據(jù)標準的步驟來進行western blot分析7。蛋白通過8-16%的Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠電泳進行大小分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。膜與一抗——兔抗人白介素-2 的多克隆抗體（ ChemiconInternational, Inc.）及二抗——堿性磷酸酶結(jié)合的驢抗兔IgG 抗體
（Pierce Biotechnology, Inc.）一起孵育。
圖3. 每天葡萄糖和乳酸水平的化學分析。WVA、WVB 和WVC 生物反應器運行的葡萄糖和乳酸水平。
圖4. 每天的蛋白濃度。三個生物反應器運行的蛋白水平的比較，以毫克/升表示。蛋白水平通過ELISA 測定。
結(jié)果
生物反應器運行WVA、WVB和WVC分別指的是Wave Biotech®的
生物反應器20/50EH系統(tǒng)、200系統(tǒng)和1000系統(tǒng)。
細胞計數(shù)與活力
圖2顯示了每種生物反應器的細胞生長和密度相當。生物反應器運行WVB沒有達到WVA和WVC那么高的細胞密度，但是確實達到了1.2×107 細胞/毫升。這是由于在第8天加入了高濃度的葡萄糖后導致的葡萄糖峰（圖3）。1.2×10在運行生物反應器WVA后，我們發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有的培養(yǎng)基配方和投料策略無法支持超過2×107 細胞/毫升以上的細胞密度。在細胞密度達到3×107 細胞/毫升后，WVA的培養(yǎng)物的細胞活力和細胞生長顯著下降，并無法恢復，這可能是由于缺乏營養(yǎng)物，以及毒性物質(zhì)的積累，包括培養(yǎng)物中的高水平乳酸（圖3）5。氧合不是一個問題，因為我們能調(diào)節(jié)向培養(yǎng)物中添加的氧氣量。每個反應器運行中的溶氧維持在73-100%。2×10
對于隨后的反應器，在細胞密度達到1.5×107 細胞/毫升或更高，乳酸水平達2.2 克/升或更高時就將部分細胞除去。通過去除細胞和調(diào)整每天的灌流量，生物反應器運行被延長，收獲了更多的蛋白。WVA需要更長時間才到達灌流密度（1.2×106 細胞/毫升），這可能是由于第6天溫度意外降至25° C。WVA灌流持續(xù)了13天，平均產(chǎn)量為12.5 毫克/升，而WVB灌流持續(xù)了18天，平均為8.3 毫克/升，比WVA多了5天，收獲蛋白也多了6.7克。WVC灌流了16天，平均產(chǎn)量為12.2 毫克/升，比WVA多了3天，收獲蛋白也增加了
16.4克。活力的增加及生物反應器運行的延長都能使產(chǎn)量更高。
蛋白產(chǎn)量
圖4比較了每個運行的蛋白濃度。WVA的蛋白濃度（37.5 毫克/升）比WVB（15.46 毫克/升）或WVC（27.91 毫克/升）更高，這是由于更高的細胞密度。每個反應器的整體蛋白產(chǎn)量如下：WVA 7.8克，WVB21.4克，WVC 149.2克。蛋白產(chǎn)量與細胞密度緊密關(guān)聯(lián)。這個解釋是合理的，因為存在更多的細胞，自然也有更多的細胞生產(chǎn)蛋白。WVB并沒有達到WVA或WVC那么高的蛋白濃度。這與觀察到的細胞密度更低是一致的。在圖、5b和5c中，每個反應器運行的細胞密度與蛋白濃度重疊。蛋白濃度的增加與細胞密度直接相關(guān)。在每個反應器運行終止時確定細胞活力的減少，以及蛋白產(chǎn)量的減少。
圖5. 蛋白水平與活細胞密度。細胞密度與蛋白水平的關(guān)聯(lián)。A. 生物反應器運行WVA。B. 生物反應器運行WVB。C. 生物反應器運行WVC。
葡萄糖和乳酸濃度
每個運行中的葡萄糖和乳酸濃度在圖3中顯示。每個運行的水平基本相似，除了第9天WVB的葡萄糖峰。由于每個反應器運行持續(xù)，細胞密度不斷增加，葡萄糖被消耗，而乳酸增加。每個運行后期葡萄糖濃度的尖峰是由于當生物反應器葡萄糖水平降低至2.0 克/升時，添加了50%的葡萄糖儲存液而引起的。
蛋白分析
AZ-IL2B 作為一個二聚體蛋白，跑膠時分子量在36-50 kDa。圖6(a)是WVD的Western blot，WVD反應器的工作體積為10 升（WaveBiotech 20/50EH系統(tǒng)）。圖6(b)是WVC的Western blot，它的工作體積為500升。圖中通過Western blot對第3天到第9天進行了比較，顯示小型反應器與大型反應器產(chǎn)生的蛋白之間并無區(qū)別。
討論
Wave Biotech的一次性生物反應器從25升放大到500升，對細胞
生長或蛋白生產(chǎn)沒有不良影響。其他影響活力和蛋白產(chǎn)量的因素包括高細胞密度、不合適的添加劑濃度，以及溫度波動。不僅每個系統(tǒng)規(guī)格所產(chǎn)生的蛋白水平相似，而且產(chǎn)生的蛋白在Western blot分析和生物活性測試（數(shù)據(jù)未顯示）時也一致。每個系統(tǒng)的細胞生長和倍增時間也是相當?shù)?。平均的蛋白濃度與細胞密度直接相關(guān)。每個生物反應器的葡萄糖消耗量與乳酸產(chǎn)量是類似的。隨著每個生物反應器的運行，葡萄糖水平下降，而乳酸水平上升選擇一次性的生物反應器實現(xiàn)了生物反應器運行之間的快速轉(zhuǎn)換。生物反應器的安裝、接種以及處理都很輕松，因此生物反應器運行的終止以及新反應器的接種能在同一天內(nèi)完成。10升、25升和100升生物反應器能在標準的8小時工作日內(nèi)取下并重新接種。500升細胞袋的清空、填充以及培養(yǎng)基預熱需要更長的時間，但生物反應器也能在2個8小時工作日內(nèi)取下并重新接種。這個過程很簡單：細胞袋清空、凈化并拋棄。新的預滅菌細胞袋放置在平臺上，并充入二氧化碳和氧氣。添加培養(yǎng)基并加熱，接著進行細胞接種。10升和25升工作體積的生物反應器一般從轉(zhuǎn)瓶中接種。100升和500升的生物反應器則從小型
的25升反應器中接種。系統(tǒng)從25升到500升的放大不僅簡單而且成比例，只需對體積變
化做出調(diào)整。而培養(yǎng)基配方或添加劑則無需改變。細胞系在25升、100升和500升反應體系中以相似的方式增殖和生產(chǎn)。
圖6. 兩個生物反應器運行的Western blot 分析。A. 生物反應器運行WVD 的工作體積為10 升。
B. 生物反應器運行WVC 的工作體積為500 升。MWM=分子量標準。
結(jié)論
成功的灌流工藝是在培養(yǎng)物健康與*產(chǎn)量之間達到平衡。適合*的細胞生長和對生長有利的因素可能對生產(chǎn)不利。例如，增加灌流速率以去除毒性物質(zhì)會將產(chǎn)物稀釋到很低的濃度，為下游處理帶來不便，更不用說與灌流增加相關(guān)的商品費用增加。對培養(yǎng)基成分、添加劑以及投料策略的調(diào)整可能會增加灌流的天數(shù)，而不稀釋蛋白的濃度水平。有報道在生物反應器運行中采用兩種不同的培養(yǎng)基配方來控制細胞代謝可降低細胞生長，同
時維持其活力，從而延長收獲產(chǎn)物的天數(shù)1。從生物反應器中去除細胞也是一個選擇，我們將它加入工藝中來控制細胞密度。這很難頻繁處理，并增加了生物危害的廢料。如果一
種培養(yǎng)基配方能支持早期的快速細胞生長，然后在生產(chǎn)中控制細胞生長，那是的。
一次性的生物反應器比反復使用的生物反應器在清洗、滅菌、驗證、安裝和運行之間的轉(zhuǎn)換時間上更具優(yōu)勢。我們證明了25升、100升和500升 工作體積的系統(tǒng)運行在細胞生長、蛋白產(chǎn)量、葡萄糖消耗以及乳酸生產(chǎn)上是相當?shù)摹?/span>
文章來源：BioProcessing™ 雜志
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